慢病毒（Lentivirus）是逆转录病毒的一种，其感染的显著特点是感染个体在出现典型的临床症状之前，大多经历长达数年的潜伏期，之后缓慢发病，因此这些病原体被称为慢病毒，Lenti在拉丁文中就是慢的意思。它包括人免疫缺陷病毒（HIV，至少有HIV-1和HIV-2两个亚型）、猫免疫缺陷病毒（FIV）、猿免疫缺陷病毒（SIV）、牛免疫缺陷病毒（BIV）等。

慢病毒基因组为双链RNA，但区别于一般的逆转录病毒，慢病毒具有更广的宿主范围，对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。重组慢病毒载体是以HIV-1（人类免疫缺陷I 型病毒）为基础发展起来的工具载体，其毒性基因已经被剔除并被外源目的基因所取代，属于假型病毒（一次性感染能力而无复制产生新病毒能力）。慢病毒可将靶基因整合到宿主的基因组中，并且能够在细胞系中稳定表达，可以进行稳转细胞株的筛选。被广泛应用于各种细胞系基因敲除、基因过表达和RNA干扰等。

HIV-1结构

HIV-1 RNA长度约为9 kb，码了9个蛋白，分别是gag、pol、vif、vpr、vpu、env、tat、rev、nef。其中三个更大的阅读框编码了三个最主要的结构蛋白：gag、pol和env。

gag — 编码病毒核心蛋白，包括基质蛋白、衣壳蛋白和核衣壳蛋白等；             

pol — 编码病毒复制所需的酶，如反转录酶、整合酶和蛋白酶；

env — 编码包膜蛋白，决定病毒感染宿主的靶向性；    

tat — 基因反式激活因子，与病毒的LTRs结合后促进病毒基因的转录；

rev — 病毒蛋白表达调节因子，调节gag、pol和env的表达水平；

vif, vpr, vpu和nef — 4个辅助因子，编码的蛋白作为毒力因子参与宿主细胞的识别和感染；

 LTR — 长末端重复序列（long terminal repeat），内含复制所需的顺式作用元件；病毒基因转录启动子；对慢病毒的转录、逆转和整合进入宿主细胞基因组都是必须的。

Ψ — 位于5'-LTR和gag基因之间，是病毒基因组二聚化和包装的必须信号。

图1. HIV-1病毒基因组

重组慢病毒系统

重组慢病毒系统是基于HIV-1病毒建立的工具系统，其将HIV-1基因组中的“顺式作用元件（如包装信号ψ、LTRs）”和“编码反式作用蛋白的序列（如gag、pol、rev、tet和env等）”进行分离，变为载体成分和包装成分。

“载体成分”包含了HIV-1包装、逆转录和整合所必须的顺式作用元件（LTRs，ψ等），并且两个LTRs间插入我们需要表达的目的序列（目的基因cDNA，shRNA或miRNA等）。

“包装成分”是去除HIV-1包装、逆转录和整合所需的顺式作用序列，留下的能编码反式作用蛋白的序列（如gag、pol、rev、tet和env等），可提供所有的转录并包装RNA 到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白。出于生物安全性考虑，将慢病毒的反式作用元件gap、pol、rev、env和tet等基因用辅助质粒表达。

慢病毒的包膜蛋白决定了感染细胞的类型。由于HIV-1病毒的env蛋白只能识别CD4受体，早期的HIV载体所能感染的宿主范围非常狭窄。病毒载体可以借助其他病原体的外壳蛋白包装成假病毒，以改变其嗜性，最常用的是疱疹性口腔炎病毒膜融合包膜G糖蛋白（VSV-G）。VSV-G有两个明显的优势：(1) VSV-G蛋白比env蛋白更加稳定，因此通过VSV-G蛋白“假型化”的病毒可以进行超离浓缩，从而获得更高的滴度。(2) VSV-G的受体是在细胞膜上广泛表达的磷脂酰丝氨酸，因此相较于env蛋白，VSV-G“假型化”病毒宿主范围变得更加广阔。目前，绝大部分慢病毒载体均采用VSV-G作为包膜蛋白。

慢病毒包装系统

现在常用的包装系统为第二代慢病毒系统（即三质粒系统）和第三代慢病毒系统（即四质粒系统）。第二代慢病毒系统含有3个质粒，第三代慢病毒系统含有4个质粒。这两代病毒系统都含有以下相同的成分：

1，编码目的序列的转移质粒（Transfer Plasmid）。目的序列可以是我们感兴趣的目的基因，shRNA或者gRNA-Cas9序列等。Transfer Plasmid其实就是我们自己构建的含有目的序列的慢病毒载体质粒。目的序列的两侧都含有LTR，LTR可以辅助目的序列插入到宿主细胞的基因组中。通常，病毒转导后整合到宿主基因组中的是LTR之间的序列，包括LTR。慢病毒质粒是基于HIV-1病毒改造的，为了安全目的，这些Transfer Plasmids都里不能复制，并且它们的3'LTR序列有所删减，这样病毒插入到基因组后会自我失活（self-inactivating，SIN）。

2，包装质粒（Packaging Plasmid），编码病毒的核心蛋白、复制所需的酶和基因表达调节因子等。

3，包膜质粒（Envelope Plasmid），编码蛋白质外壳。

第二代慢病毒系统：

图2. 第二代慢病毒系统

这个系统含有3个质粒：

第1个质粒：包装质粒（Packaging Plasmid），它编码gag，pol，rev与tat基因。删除了vif, vpr, vpu和nef 4个毒力因子，因其对病毒的致病性是必须的，但去除后不影响病毒的滴度和感染能力。

第2个质粒：包膜质粒（Envelope Plasmid），含有VSV-G序列（用以替换env序列），编码包膜蛋白。

第3个质粒：转移质粒（Transfer Plasmid），含有病毒的LTRs和Ψ包装信号（图片未画出），除非有内部启动子，否则这个Transfer Plasmid的目的序列是由5'LTR驱动的，它是一个弱启动子，需要Tat元件激活。所有的第2代慢病毒Transfer Plasmid必须要用第2代慢病毒包装系统，因为它的LTR是Tat依赖性的。而第3代慢病毒包装系统不能包装第二代Transfer Plasmid，因为不表达Tat。

第三代慢病毒系统：

图3. 第三代慢病毒系统

设计第3代慢病毒系统的目的主要还是提高安全性。第3代慢病毒系统，将第2代慢病毒系统的Packaging Plasmid分成了2个质粒，一个编码rev，另外一个编码gag和pol。虽然第3代慢病毒包装系统更为安全，但使用时更麻烦，并且由于添加了一个额外的质粒导致它的效率降低了。除此之外，第3代慢病毒包装系统删除了Tat元件，并且Transfer Plasmid 5'LTR被部分删除并融合上异源增强子/启动子（如CMV或者RSV启动子），该启动子驱动目的序列表达并不依赖于Tat元件。第3代病毒的Transfer Plasmid可以使用第2代或第3代的包装质粒。

注意：第三代慢病毒包装系统只能包装第三代慢病毒转移质粒，但是第二代慢病毒包装系统既能包装第二代，也能包装第三代慢病毒转移质粒。

第二代慢病毒系统与第三代慢病毒系统的区别

常用包装质粒总结

包装步骤

详见慢病毒包装试剂盒（江苑生物 JY03021）说明书。