江苑生物：慢病毒滴度测定方法、步骤和原理全攻略

经纯化和浓缩的慢病毒建议先进行滴度测定，再用于感染目的细胞。常用的慢病毒滴度测定方法有4种，分别是：

(1) 荧光计数法

(2) 定量PCR法检测整合到基因组DNA中的病毒序列

(3) p24蛋白ELISA试剂盒检测法

(4) qRT-PCR试剂盒检测法检测病毒样本中的基因组拷贝数

前两种方法检测的是病毒活性滴度，需要用病毒感染细胞，检测过程一般需要5~10天；后两种方法检测的是病毒的物理滴度（即不能区分有感染能力的病毒颗粒和无感染活性的死病毒），可以在1~2天内完成。需要说明的是：滴度检测方法不同，病毒滴度值可能有所差异。

活性滴度：TU/mL，指每毫升中含有的具有生物活性的病毒颗粒数。「TU」为「transducing units」的缩写，中文为「转导单位」，表示可以感染并进入到靶细胞中的病毒基因组数。

若用慢病毒建立普通的过表达、敲除和敲降等细胞系，可以用抗生素或者流式筛选出阳性细胞，对滴度要求并不严格，测物理滴度和活性滴度均可。在一些比较严格实验中，比如用慢病毒做RNAi-screening或CRISPR-screening，需要严格控制MOI，就需要测定慢病毒的活性滴度。

1. 荧光计数法测定滴度的操作方法

(1) 测定前，将生长状态良好的293T细胞铺入96孔板，每个孔加5×10³个细胞，体积为100 μL。（江苑生物用的293T细胞，也可以使用其他易感染细胞，如H1299、HT1080细胞等，但用不同细胞标定的滴度值会有所差异）。

(2) 感染前，对待检测的病毒样品进行10倍的梯度稀释。操作方法为：准备8个无菌的EP管，每个管子中加入90µL细胞培养基，取待测定的病毒样品10 µL加入到个管中，混匀后，取10 µL加入到第二个管中混匀，继续相同的操作直到最后一管。（每个梯度可多做复孔，减少实验误差）。

(3) 选取所需的细胞孔，吸去96孔板中原有的培养基，加入90 μL稀释好的病毒溶液，并做好标记。放入培养箱培养，小心操作，不要吹起细胞。培养过程中适当更换培养基以维持细胞正常生长。

(4) 37℃，5% CO₂培养48小时后，加入新鲜培养基100 µL，再经过24小时候，更换新鲜培养基150 µL。（小心操作，避免细胞被吹起）

(5) 96小时后，观察荧光表达情况，统计荧光细胞个数。若病毒本身只带有Puromycin筛选抗性，则感染后48小时加入抗性药物Puromycin，维持药物浓度在5 μg/mL。继续培养2天，观察细胞生长状况，计算具有抗性的细胞数。

滴度的计算：

用荧光显微镜对荧光阳性细胞进行计数，数出最后一个能观察到荧光的孔内的荧光细胞数，荧光细胞数除以病毒原液量即为该病毒的滴度。

根据下述荧光图片中GFP表达情况，在加入10^-6 μL病毒原液的孔中观察到2个带有荧光的细胞，说明该孔中至少有2个病毒颗粒感染了细胞，则该病毒的滴度等于带有荧光的细胞数除以病毒原液量，本例子中就是2/(10^-6)=2×10⁶，单位为TU/μL，也就等于2×10⁹ TU/mL。

该方法还可以用于检测带有Puromycin抗性标记的慢病毒的滴度（根据Puromycin抗性培养基下活细胞的数量来判断），如果在加入10^-5 μL病毒原液的孔中观察到3个细胞存活，说明该孔中至少有3个病毒颗粒感染了细胞，则该病毒的滴度等于活的细胞数除以病毒原液量，即3/(10^-5)=3×10⁵，单位为 TU/μL，也就等于3×10⁸ TU/mL。

图1. 一组孔稀释法滴度测定过程中病毒感染293T细胞后的荧光照片（仅供参考）

2. 定量PCR法检测整合到基因组DNA中的病毒序列

(1) 样品制备

(a) 检测前，对293T细胞传代，每个24孔中加1×10⁵个细胞，体积为500 μL；

(b) 按照上述类似方法10倍梯度稀释样品；

(c) 选取所需的细胞孔，吸去90 μL培养基。加90 μL入稀释好的病毒溶液。放入37℃ 5% CO₂培养箱中培养；留一组不用病毒处理，作为Control组；

(d) 48小时后，加入新鲜培养基500 μL。小心操作，不要吹起细胞；

(e) 4天后，抽提RNA准备做RT-qPCR。

(2) RNA逆转录获cDNA。

(3) 定量PCR检测，同时以Actin作为内参基因。

示例: 定量PCR法测定慢病毒滴度（目的慢病毒中含有GFP基因序列，Control组中不含有GFP序列，检测过程以针对GFP序列设计扩增引物，同时以Actin作为内参），扩增曲线图参见图2。

图2. 定量PCR曲线图（仅供参考）

表1. 定量PCR检测数据（仅供参考）

注：曲线颜色和样品颜色相同

滴度计算：

通过比较Control组和试验组的Ct值差异判断滴度值。Control组无GFP序列，故Ct值较大。通常情况下，认为Ct值差异2以上存在显著差异。即若试验组Ct值小于Control组Ct值超过2，则试验组与Control组存在显著差异，即试验组具有GFP序列。

反转录反应所获得的20 μL cDNA中只取了1 μL用于实时定量检测，所以该结果仅表示1/20样品的情况，所以在滴度计算时应该乘以系数20。

在本次滴度检测中，10^-5 μL组样品检测到目的基因GFP的表达，且与Control组间Ct值差异明显（Ct值相差3左右），所以认为在10^-5 μL组样品中存在病毒颗粒。假定该组样品含有至少有1个病毒颗粒，则病毒的滴度为：

1/(10^-5 μL) ×20＝2×10⁶ TU/μL=2×10⁹ TU/mL

滴度值： >2×10⁹ TU/mL

3. p24蛋白ELSIA试剂盒法测定慢病毒滴度

检测原理：采用固相酶联免疫吸附分析法（Enzyme-linked Immunosorbent Assay，ELISA）检测样品中的HIV-1 p24抗原。慢病毒样品中HIV-1 p24抗原与固相抗-p24单克隆抗体和生物素标记的抗-p24多克隆抗体通过免疫反应，形成固相抗-p24单克隆抗体—p24抗原—抗-p24多克隆抗体-生物素复合物；然后加入HRP（Horseradish Peroxidase，辣根过氧化物酶）标记的链亲和素，形成固相抗-p24单克隆抗体—p24抗原—抗-p24多克隆抗体-生物素—链亲和素-HRP复合物；加入TMB-H₂O₂底物溶液，HRP催化H₂O₂氧化TMB生成蓝色的产物（更大吸收峰655nm），加入终止液终止酶催化反应，生成黄色产物（更大吸收峰450nm）。其吸光度与校准品和样品中的HIV-1 p24抗原浓度成正相关。通过建立标准样品曲线可得出样品中 HIV-1 p24抗原浓度。

其主要步骤为（详细方法参见市售的p24 ELISA试剂盒）：

(1) 样品准备和稀释

(2) 标准曲线样品制备

(3) 样品检测

(4) 检测数据分析

值得注意的是，该方法最终得出的样品中p24蛋白的含量，单位为pg/mL，是物理单位。

要区别于活性单位TU/mL，因此，采用不同方法检测的病毒滴度在病毒感染细胞时根据滴度需要加入的病毒量也有所差异。

4. qRT-PCR试剂盒检测病毒样本中的基因组拷贝数

检测原理：用特异性引物能够对以HIV-1为结构基础的慢病毒样品的RNA基因组的保守序列进行特异性扩增，通过qRT-PCR对产物进行实时监测。用标准品扩增得到的CT值绘制标准曲线，将待测病毒样本反应的C_T值带入标准曲线，计算得到病毒样本中的RNA 基因组拷贝数，即病毒颗粒数（copies/mL）。

关于qRT-PCR法测定病毒样品中RNA的方法操作步骤详细请参考对应的试剂盒说明书。